Kancerogenezės tyrimas ir įvertinimas

Kancerogenezė tiriama atliekant įvairius standartizuotus toksikologinius tyrimus. Pirmoji šių bandymų dalis atliekama in vitro ir, jei jie yra teigiami, atliekame eksperimentą in vivo. Šis eksperimentinis žingsnis po žingsnio metodas vadinamas SPRENDIMO TAŠKO METODU-bandymų seka, kuri sustoja kiekvieno bandymo pabaigoje, kad nuspręstų, kaip tęsti tyrimą. Yra penki etapai:

A ETAPAS: kancerogeninio junginio sandara ir savybės;

PHASEB: šiame trumpalaikio in vitro tyrimo etape naudojamos žinduolių ląstelės. Dažniausiai naudojamos ląstelės yra hepatocitai, nes tiriamas hepatocitų išsivystymo pažeidimo laipsnis, atsižvelgiant į medžiagos sukeltos žalos sunkumą. Trumpai tariant, mes nustatome ne žalą per se, bet tai, kiek remonto sistemos suaktyvino kepenų ląstelė.

Taikoma procedūra yra suformuoti 3 hepatocitų kultūras. Pirmojoje kultūroje hepatocitai yra sveiki, antroje - gydomi bandomąja medžiaga, o galiausiai trečioje - kontroline medžiaga, kuri tikrai yra kancerogeninė.Šiose trijose kultūrose yra radioaktyvi pirimidino bazė, tritijuotas timidinas, kuris veikia kaip žymeklis.

Jei tiriamas junginys sukelia DNR mutaciją, ląstelė reaguoja į šią problemą aktyvuodama remonto sistemas. Mutaciją patyręs DNR gabalas supjaustomas ir dėl DNR polimerazės veikimo trūkstamas gabalas pakeičiamas nauju. Korekcijai DNR polimerazė naudoja naujas bazes, įskaitant trišakį timidiną. Įterpiama radioaktyvi bazė. Radioaktyvumo analizė nustato mutacijų lygį apdorotose ląstelėse: kuo didesnis radioaktyvumas, tuo didesnės DNR mutacijos.

Taip pat B fazės bandymai taip pat atliekami su bakterijomis, kad būtų galima ištirti, ar nėra atvirkštinių mutacijų. Naudojamos bakterijos yra salmonelės, kurios jau yra mutacijų nešiotojos. Mutacija susijusi su histidino sinteze, todėl salmonelės negali augti be histidino. Šios bakterijų kolonijos iš dalies imamos gydyti bandomąja medžiaga, iš dalies - neigiamai kontrolei, iš dalies - teigiamai kontrolei, po to tiriamos žinomu kancerogenu. Jei ši bandomoji medžiaga yra netiesioginis genotoksinis, į auginimo terpę reikia įterpti metabolizuojančių fermentų. Šiuo metu yra 3 kultūros, kurios bus sėjamos ir auginamos Petri lėkštelėse (kultivavimo terpėje nėra histidino). Jei nebuvo jokių kancerogeno mutacijų, kurias reikia išbandyti, teoriškai plokštelėse jų neturėtų būti . Jei kancerogenas sukėlė mutageninį poveikį, tai galėjo pakeisti pirmąją mutaciją ir sukurti antrąją mutaciją, galinčią auginti bakterijas auginimo terpėje, kurioje nėra histidino. Šiuo atveju antroji mutacija, kuri pakeičia pirmąją mutaciją ir pagal RETROMUTATION pavadinimą Galiausiai, jei piasta petri žymiai padidėja, kancerogenas yra tiesioginis.
Visada atliekant in vitro bandymą galima nustatyti chromosomų vientisumą. Šis bandymas visada atliekamas su žinduolių ląstelėmis ir naudojamas toksinėms medžiagoms, galinčioms sukelti mutacijas kai kuriems fermentams, atsakingiems už DNR biosintezę, tirti. atliekama in vitro analizė Kad būtų galima nustatyti, ar tiriama medžiaga turi įtakos esančių chromosomų vientisumui ir skaičiui, naudojamas mikrobranduolių tyrimas. Mikrobranduoliai yra pūslelės, susidarančios su chromatino dalimi. Į šiuos mikrobranduolius įtrauktas chromatinas gali būti ištisos chromosomos arba chromosomų fragmentai. Mikrobranduoliai susidaro dėl neteisingo ląstelių dalijimosi, todėl atsiranda dukterinės ląstelės, kurių genetinė medžiaga nevienoda Šio bandymo rezultatas bus medžiagų, kurios yra klastogeninės ir verpstės nuodai, nustatymas. Klastogeninė medžiaga gamina mikrobranduolius su centriniais chromosomų fragmentais, todėl medžiaga sukelia chromosomų lūžimą, o verpstės nuodinga medžiaga mikrobranduolių, esančių jo viduje, yra visos chromosomos.
Jei tiriama medžiaga per vieną ar kelis bandymus sukelia genotoksinį poveikį, tai apibrėžiama kaip labai įtartina, todėl ji pereina tiesiai į D fazę. Jei, kita vertus, tiriama medžiaga nesukelia jokio genotoksinio poveikio, ji pereina į tyrimo etapą C, nes jis gali būti skatintojas.

FASEC: šioje fazėje galima atlikti ir in vitro, ir in vivo bandymus.

Atliekant in vitro bandymus, buvo įrodyta, kad promotoriaus medžiaga gali sulaužyti atotrūkio jungtis tarp normalių ląstelių ir naviko ląstelių, todėl medžiagos patenka tarp dviejų ląstelių.

In vivo testas yra pelių odos navikų sukėlimas. Tiriamoji medžiaga du ar tris kartus per savaitę uždedama ant pelės odos. Per 2/3 mėnesius, jei ši medžiaga yra promotorius, gali atsirasti papilomos formacijų. Pelių atveju atsižvelgiama į du pagrindinius duomenis: pelių, paveiktų papilomų, skaičių ir papilomų skaičių kiekviename gyvūne. Jei medžiaga veikia kaip promotorius ir gydomoje pelėje išsivysto navikas, tai reiškia, kad tai tikrai medžiaga, turinti promotoriaus poveikį.

Kai šie bandymai bus baigti, pereisime prie ilgalaikių in vivo bandymų.

FASED: šioje fazėje tiriami visi junginiai, kurie įrodo mutageniškumą, ir visi junginiai, kurie neįrodo mutageniškumo. Tyrimai, kuriuos galima atlikti, yra skirtingi, kai kurie iš jų yra kepenų, plaučių ir galiausiai krūties tyrimai.

Kepenų tyrimas rodo, kad susidaro ne naujai susiformavęs navikas, o neoplastinis židinys, todėl kažkas, kas ruošiasi tapti naviku. Šio židinio ląstelės jau yra netipinės ląstelės, todėl joms įvyko mutacija ir jos ruošiasi tapti neoplastinėmis ląstelėmis. Po tam tikro laiko, skrodimo tyrimo dėka, nustatomas priešneoplastinių židinių susidarymas, apskaičiuojant šių priešneoplastinių darinių skaičių ir mastą.

Plaučių tyrimas leidžia nustatyti adenomą, kuri yra „plaučių audinio ląstelių anomalija. Taip pat šiuo atveju žiurkės plaučių audinys tiriamas po gana ilgo laiko (mėnesių) (šios adenomos yra lengvai atpažįstamos, nes yra balkšvi mazgeliai ant plaučių epitelio).
Krūties tyrimas leidžia nustatyti navikus liaukiniame audinyje. Visada įvertinamas susidariusių adenomų skaičius ir gyvūnų, turinčių adenomą, skaičius.

Jei šių bandymų rezultatai yra teigiami, bandomoji medžiaga tikrai yra kancerogenas. Šiuo metu mes pradedame atlikti brangius testus, kurių vykdymo laikas yra labai ilgas.

ETAPAS: šiame etape kintamam gyvūnų skaičiui, nuo 20 iki 50, atliekami ilgalaikiai bandymai, kurie yra labai brangūs ir užtrunka ilgai, kol gaunami tam tikri rezultatai; mes kalbame apie 1/8 gyvūno gyvenimo. Gali būti, kad šių bandymų metu kai kurie gyvūnai miršta, tačiau jie visada tiriami atliekant skrodimą ir atliekant histologinį tipo tyrimą. Pasirinkti gyvūnai visada yra žiurkės ir pelės, ir tik 70–80% išgyvena iki ilgalaikių bandymų pabaigos. Naudojami gyvūnai yra tik nujunkyti, nes kuo jaunesni, tuo jautresni gydymui. Ilgalaikio bandymo laikotarpiu tyrėją visada palaiko matematikas-statistikas, galintis atsižvelgti į visą surinktą informaciją ir atkurti įvairius duomenis.

Su gyvūnais tirtos dozės prasideda nuo didžiausios toleruojamos dozės ir visų jos dalinių, o gyvūno dozės ir atsako reakcija yra vertinama.
Skiriant vaistą, visada reikia kreiptis į kelią, per kurį žmogus gali liestis su tiriamąja medžiaga, todėl per burną, per odą ar kvėpavimo takus, o jei tiriamas vaisto kancerogeniškumas, tai taip pat naudinga atlikti į veną.
Išbandytos 4 gyvūnų grupės (50 gyvūnų kiekvienai grupei):

NAIF grupė, kuri nėra gydoma;
Transporto priemone gydyta grupė;
Grupė, apdorota bandomąja medžiaga;
Grupė, gydoma žinomu kancerogenu.

Labai svarbu, kad kiekvienos grupės gyvūnų skaičius būtų kuo lygesnis.Iš tiesų, jei gyvūnų skaičius labai skiriasi, statistinis testas gali pasirodyti klastingas.
Atliekami šie vertinimai:

Bendras navikų dažnis;
Kai kurių navikų dažnis;
Gyvūnų, sergančių daugiau nei vieno tipo navikais, dažnis;
Gyvūnų vėžio atvejų skaičius.

Visų šių tyrimo etapų pabaigoje medžiaga klasifikuojama pagal IARC (Tarptautinės vėžio tyrimų ir plėtros agentūros) ir Aplinkos apsaugos agentūros (EPA) nustatytą reitingą.